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CRISPR/Cas9基因敲除

來源:萬物   發(fā)布時間:2021-08-31

CRISPR/Cas9基因敲除

CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一種來自細菌降解 入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。在細菌及古細菌中,CRISPR系統(tǒng)共分成3類,其中類和類需要多種CRISPR相關(guān)蛋白(Cas蛋白)共同發(fā)揮作用,而類系統(tǒng)只需要一種Cas蛋白即可,這為其能夠廣泛應(yīng)用提供了便利條件。

目前,來自StreptococcuspyogenesCRISPR-Cas9系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。Cas9蛋白(含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域,可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNAtracrRNA結(jié)合成復(fù)合物,然后通過PAM序列結(jié)合并侵入DNA,形成RNA-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu),進而對目的DNA雙鏈進行切割,使DNA雙鏈斷裂。 由于PAM序列結(jié)構(gòu)簡單(5’-NGG-3’),幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點,因此得到廣泛的應(yīng)用。CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞,是目前最高效的基因組編輯系統(tǒng)。

通過基因工程手段對crRNAtracrRNA進行改造,將其連接在一起得到sgRNAsingleguideRNA。融合的RNA具有與野生型RNA類似的活力,但因為結(jié)構(gòu)得到了簡化更方便研究者使用。通過將表達sgRNA的原件與表達Cas9的原件相連接,得到可以同時表達兩者的質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染細胞,便能夠?qū)δ康幕蜻M行操作。

作為一種新的基因編輯技術(shù),CRISPR/Cas9有以下特點和優(yōu)勢

1、靶向精確性更高。RNA靶向序列和基因組序列必須完全匹配,Cas9才會對DNA進行剪切。

2、可實現(xiàn)對靶基因多個位點同時敲除。

3、實驗周期短,最快僅需2個月,節(jié)省大量時間和成本。

4、無物種限制。

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